« Évaluation des effets adaptogènes de Rhodiola rosea sur les réponses comportementales et physiologiques au stress chronique : du développement biotechnologique à l’application préclinique » par Mme Camille LELONG
Défense publique de thèse de doctorat en vue de l’obtention du grade académique de Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
Promotrice : Prof. Laurence RIS, Service de neurosciences, UMONS
C-promotrice :Prof. Sylvie DEFRERE, Botalys, R&D director
Président du jury : Prof. Pierre DUEZ, Service de Chimie thérapeutique et pharmacognosie, UMONS
Secrétaire du jury : Dr. Agnès VILLERS
Membres du jury :
- Dr. Nicolas DESOIGNIES (Professeur à Gembloux Agro-Bio Tech – ULiège, Professeur à la haute école Condorcet)
- Dr. Sylviane DELANNAY (Professeur de biochimie à la haute école Condorcet)
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), ou maladie de Steinert, est une pathologie génétique à transmission autosomique dominante multisystémique. Causée par une mutation présente sur le gène DMPK au niveau du chromosome 19 (19q13.3), elle est caractérisée par une expansion trinucléotidique [CTG]n considérée pathologique à partir de 50 répétitions. Cette séquence d’ADN est ensuite transcrite en une séquence d’ARN composée de répétitions [CUG]n adoptant une conformation particulière dite en « épingle à cheveux ». Cette structure est capable d’interagir et de séquestrer des facteurs d’épissage tels que MBNL1 formant des agglomérats nommés foci au sein des noyaux cellulaires. Cette séquestration est à l’origine des différents symptômes provoqués par une indisponibilité de MBNL1, ne lui permettant pas d’accomplir son rôle physiologique dans l’épissage alternatif de nombreux gènes. Avec un taux de prévalence pouvant atteindre 1/2400 cas, la DM1 reste cependant incurable à ce jour. Parmi les nombreuses stratégies thérapeutiques envisagées, l’emploi de molécules de faibles masses moléculaires semble être une piste prometteuse afin d’inhiber la séquestration du facteur d’épissage, rendu de cette façon à nouveau disponible pour l’épissage alternatif du génome.
Dans ce contexte la pentamidine (PTMD), une diamidine aromatique, a montré une certaine capacité à dissocier le complexe [CUG]n-MBNL1 et à réduire le nombre de noyaux cellulaires présentant des foci. In vitro et in vivo, cette rupture a restauré l’épissage alternatif de certains gènes affectés par la pathologique. Cependant la PTMD présente une toxicité élevée in vitro et in vivo qui ne permet pas d’atteindre les concentrations nécessaires à la restauration totale de l’épissage alternatif des gènes étudiés.
En s’inspirant de cette approche thérapeutique, mettre en évidence et quantifier l’interaction de nouveaux composés revêt un intérêt stratégique. Dans cette optique, ce travail de recherche se propose de développer et optimiser une méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) intégrant un modèle ARN représentatif de la pathologie.
La première partie de ce travail est dédiée à la production du matériel biologique essentiel à l’évaluation de nouveaux candidats thérapeutiques. Les sondes ARN [CUG]95 (contrôle positif) et [CUG]14 (contrôle négatif) ont été synthétisées par (i) transformation bactérienne, (ii) amplification et extraction des plasmides contenant les répétitions [CTG]95 et [CTG]14, (iii) linéarisation, (iv) purification et (v) transcription in vitro de ces séquences d’ADN.
Le deuxième volet de ce travail de thèse comporte le développement de la méthode d’électrophorèse capillaire d’affinité. Les paramètres optimisés de prétraitement et de coating du capillaire permettent d’obtenir des temps de migration très répétables, primordiaux pour l’obtention de résultats analytiques de hautes qualités. Le potentiel de cette méthode ACE a été évalué et confirmé par quantification de l’interaction entre la PTMD (molécule de référence) et les sondes ARN synthétisées. Différents groupes de molécules (solubles et insolubles en milieu aqueux) ont été étudiés dont ont émergé 3 composés (la chloroquine et 2 analogues structurels de la PTMD) interagissant spécifiquement avec l’ARN représentatif de la pathologie.
La 3ème phase de ce travail consiste à développer une méthode orthogonale chromatographique (UPLC-UV) pour re-déterminer les interactions de la PTMD avec les sondes ARN [CUG]95 et [CUG]14, afin de comparer les valeurs de constantes d’affinité ARN-ligand obtenues. Les résultats générés par les deux méthodes, vu l’absence de différences significatives démontrée par une analyse des variances (test ANOVA), mettent en avant la capacité de la méthode ACE pour la quantification des interactions petites molécules – sondes ARN dans le contexte de la DM1.
Dans la dernière partie de ce travail de thèse, les 3 candidats retenus ont fait l’objet d’une évaluation biologique. Premièrement une étude de cytotoxicité sur des cellules HeLa (test au cristal violet) a déterminé les concentrations maximales de chaque composé pour un pourcentage de viabilité de 100 %. En second lieu à l’aide d’un modèle cellulaire HeLa transfecté avec un plasmide incluant une séquence de 960 répétitions du trinucléotide [CTG] et un plasmide codant pour la protéine fusion MBNL1-GFP, nous avons quantifié le nombre de noyaux présentant des foci par microscopie à fluorescence. La tendance à la diminution du nombre de noyaux présentant des foci avant et après traitement par les différents composés semble confirmer la rupture du complexe [CUG]n-MBNL1 in vitro.
En conclusion, ces travaux ont permis de développer une méthode ACE optimisée forte d’un haut degré de répétabilité des temps de migration et efficace pour la quantification de l’interaction entre des petites molécules et des sondes de type ARN. La chloroquine et deux analogues de la PTMD ont montré une interaction spécifique à l’encontre du modèle ARN représentatif de la DM1 et tendent à montrer in vitro, une capacité à rompre le complexe [CUG]n-MBNL1. Elles présentent par conséquent un intérêt thérapeutique pour le traitement de la DM1 et motivent la mise en place de travaux complémentaires.
7000 Mons, Belgium
